下調STAT3基因對食管癌細胞TE1凋亡的影響

下調STAT3基因對食管癌細胞TE1凋亡的影響

作者:師大云端圖書館 時間:2019-07-23 分類:參考文獻 喜歡:2327
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【摘要】食管癌作為一種消化系統惡性腫瘤,嚴重威脅人們身體健康、影響生活質量。據流行病學調查顯示,我國是全球食管癌的高發地帶,每年因食管癌死亡人數達15萬余人,位居世界食管癌死亡人數的第一位。食管癌的發生與飲食習慣、致癌物質、疾病、遺傳、環境等因素都密切相關。目前,治療食管癌的臨床方法主要有手術療法、放射療法、化療藥物療法、包括內鏡療法在內的非手術療法等。但食管癌早期診斷困難,且惡性程度高,一經診斷,已至晚期,所以目前食管癌的治療效果和預后仍然很差,5年生存率仍低于30%。隨著分子生物學在腫瘤病因學研究方面的發展,人們對食管癌的發病原因逐步有了新的認識。目前普遍認為食管癌的發生涉及多種因素,多種基因,并且在多階段發揮作用,利用在分子生物手段對其早期診斷、治療及預防具有重要意義。研究發現STAT3在食管鱗癌細胞中高表達,本實驗以其為靶點,探討下調STAT3基因表達誘導食管鱗癌細胞TE1凋亡的分子機制。實驗目的:(1)本實驗選用針對STAT3的長效RNA干擾質粒psilencer-shRNA-stat3,通過脂質體轉染食管鱗癌細胞TE1,以期達到沉默STAT3基因表達的效果。(2)探討下調STAT3基因表達,抑制食管癌TE1細胞增殖、誘導細胞凋亡的分子機制。實驗方法:選用針對人STAT3mRNA序列設計的質粒psilencer-shRNA-stat3和陰性對照質粒psilencer-shRNA-scramble通過脂質體2000轉染食管鱗癌細胞TE1。免疫印跡分析轉染后TE1細胞STAT3蛋白,細胞周期蛋白CyclinB1,癌蛋白C-myc,抑癌蛋白P53,抗凋亡蛋白Bcl-2,凋亡相關蛋白Caspase-3(32KDa,17KDa)表達水平。流式細胞儀分析轉染后TE1細胞周期分布。提取轉染后TE1細胞基因組DNA電泳分析細胞凋亡。熒光顯微鏡觀察轉染后TE1細胞線粒體膜電位變化。Annexin-V-FLOUS試劑盒處理轉染后TE1細胞,流式細胞儀分析細胞凋亡率。TUNEL法檢測轉染后TE1細胞的凋亡。實驗結果:(1)蛋白免疫印跡分析結果證實,shRNA-stat3組(轉染psilencer-shRNA-stat3質粒組)TE1細胞中STAT3蛋白表達水平顯著低于shRNA-scramble組(轉染psilencer-shRNA-scramble質粒組)(p<0.05),提示質粒psilencer-shRNA-stat3表達的stat3-shRNA能夠有效抑制STAT3基因表達。(2)流式細胞儀分析轉染后TE1細胞周期分布變化。結果顯示,shRNA-stat3組細胞S期細胞數顯著低于shRNA-scramble組(p<0.05),而G2/M期細胞數則顯著高shRNA-scramble組(p<0.05),提示抑制STAT3基因表達引發TE1細胞在增殖過程中發生了G2/M期阻滯。進一步通過免疫印跡法檢測細胞G2/M期關鍵周期蛋白CyclinB1表達水平,結果證實shRNA-stat3組CyclinB1表達水平顯著低于shRNA-scramble組(p<0.05),提示下調CyclinB1為TE1細胞產生G2/M期阻滯的原因。(3)光學顯微鏡觀察轉染后TE1細胞形態,顯示轉染后細胞皺縮、變圓、內部顆粒物增多,細胞間連接消失,這是凋亡細胞的典型特征。據此本實驗通過多種凋亡檢測方法分析轉染后TE1細胞的凋亡。DNALadder電泳結果顯示shRNA-stat3組的細胞基因組DNA在180~1000bp有較為明顯的小片段DNA。熒光顯微鏡下觀察TUNEL凋亡試劑盒處理的轉染后TE1細胞結果顯示shRNA-stat3組細胞凋亡率20%以上。熒光顯微鏡下觀察轉染后TE1細胞線粒體膜電位變化顯示,shRNA-stat3組凋亡細胞比例約為30%,而shRNA-scramble組和control組凋亡細胞數目可以忽略不計。用流式細胞儀分析Annexin-V-FLOUS試劑盒處理的轉染后24h和48hTE1細胞,凋亡率分別為29.06%和43.32%(p<0.05),顯著高于shRNA-scramble組。與膜電位檢測和TUNEL法檢測的細胞凋亡率相一致。(4)為進一步在分子水平上探討TE1細胞的凋亡機制,通過免疫印跡法檢測細胞凋亡相關蛋白表達水平,結果顯示shRNA-stat3組細胞凋亡蛋白酶原型Caspase-3(32KDa)表達水平顯著低于shRNA-scramble組(p<0.05),而凋亡蛋白活化型Caspase-3(17KDa)表達量顯著高于shRNA-scramble組(p<0.05),二者是細胞凋亡的執行者,是細胞發生凋亡的直接標志分子。另外原癌蛋白C-myc表達量下調,抑制了TE1細胞增殖。同時抑癌蛋白P53表達上調,抗凋蛋白Bcl-2表達下調,有研究表明二者協同作用,可誘導細胞凋亡。實驗結論:(1)轉染psilencer-shRNA-stat3質粒能夠有效地下調TE1細胞STAT3基因表達。(2)下調STAT3基因表達,抑制了細胞周期蛋白CyclinB1的表達,引起食管鱗癌細胞TE1發生了G2/M期阻滯。(3)下調STAT3基因表達,引起抑癌蛋白P53表達上調,抗凋蛋白Bcl-2表達下調,連同原癌基因蛋白產物C-myc下調和細胞周期蛋白CyclinB1下調共同激活Caspase-3通過經典細胞內凋亡途徑—線粒體途徑,誘導TE1細胞凋亡。
【作者】邵丹;
【導師】焦平;
【作者基本信息】吉林大學,生物醫學工程,2014,碩士
【關鍵詞】食管癌細胞TE1;STAT3;RNA干擾;細胞凋亡;

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